Efecto de la suplementación proteica Apipromotor® a distintos pH sobre los niveles de expresión de vitelogenina y proteínas totales en cuerpos grasos abdominales de Apis mellifera. (Segunda parte)

Estudios de expresión génica
Los abdómenes de cada abeja fueron obtenidos por sección del propodeum. Los segmentos abdominales, junto con los cuerpos grasos adheridos a ellos por defecto, fueron procesados según TriReagent  (Ambion) para obtener el ARN.
La retrotranscripción se realizó mediante la enzima MMLV  (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) a partir de 1 µg del ARN tratado previamente obteniendo así el ADNcopy.
Las reacciones de PCR en tiempo Real se llevaron a cabo utilizando una mezcla preformada y optimizada (EvaGreen, Biodynamics). La detección del producto amplificado por aumento de la fluorescencia en el tiempo se registró en un equipo Rotor Gene.
Con el fin de corroborar la amplificación del producto del peso molecular esperado, los productos de la PCR fueron corridos en geles de agarosa 2,5% y  teñidos con una solución 0,5 μg/ml de bromuro de etidio en buffer TBE 1X y visualizados en un transiluminador U.V.

Determinación de Proteínas Totales en cuerpos grasos
Las proteínas totales fueron precipitadas del sobrenadante producto de la sedimentación del pellet de RNA y la cuantificación midiendo absorbancia a 595 nm. Se realizó por la técnica de Bradford (Bradford, 1976). Para la curva de calibración se utilizó seroalbúmina bovina como proteína estándar.

Resultados
Los negativos de retrotranscripción  para  los dos pares de primersde beta actina y Vg no presentaron producto de PCR y se obtuvo en todas las reacciones la amplificación  del producto del peso molecular esperado.
Las eficiencias de amplificación fueron para ambos genes cercanas al 100%
El resultado de de la corrida electroforética en geles de agarosa corroboró la presencia de las bandas de los pesos moleculares esperados para cada gen en los productos amplificados.
Los niveles de expresión de Vg (Fig. 5) y proteína total (Fig. 6) correspondientes tiempo 1 no presentaron diferencias significativas entre los Grupos 1, 2, 5 y 6, pero si   resultaron significativamente diferentes a los obtenidos en los  Grupos 3 y 4.
Para el tiempo 2, los niveles de Vg de los grupos 3 y 4 resultaron superiores al resto de los grupos, si bien son estadísticamente diferentes a los grupos 5 y 6, no se encontraron diferencias significativas con los grupos 1 y 2, debido a la alta dispersión registrada por estos grupos en este tiempo de estudio. En contraposición a este resultado, los valores de proteína total para estos grupos fueron significativamente menores que en  los grupos 1, 2, 5 y 6.
En el tiempo 3 los niveles tanto de Vg como de proteína total no presentaron diferencias significativas entre los grupos. 

Discusión
En base a los resultados obtenidos, se puede constatar que ante la disponibilidad de una fuente proteica,  los niveles de proteínas totales, junto con la expresión génica de Vg  presentan un máximo en la edad correspondiente a la obrera nodriza, para luego decrecer paulatinamente en concordancia con lo propuesto por numerosos autores  (Fluri et al., 1982; Amdam et al., 2006)
Estos resultados se presentaron ante la disponibilidad ad libitum de una fuente proteica, ya sea natural (polen ensilado) o artificial como el compuesto Apipromotor® sin una diferencia significativa entre ambos.
De esto se desprende que el formulado nutricional para abejas Apipromotor® resulta capaz de suplir las demandas proteicas de la abeja nodriza, permitiendo en condiciones de carencia natural que la abeja cumpla con normalidad las distintas etapas de su desarrollo.
Esta conclusión se refuerza al analizar el comportamiento de los niveles de expresión de Vg en los grupos carentes de oferta proteica.
Bajo estas condiciones, los organismos presentaron el nivel de expresión génica máximo a los 10 días de emergidas mientras que en las abejas con disponibilidad de proteínas se presentó a los 5 días. Pese a este incremento tardío de ARNm los títulos de proteínas totales registrados no respondieron de igual forma debido a la carencia de materia prima.
En todos los casos,  a los 21 días se registraron los niveles más bajos en ambos parámetros, demostrando que en presencia o ausencia de proteínas disponibles, la producción de ARNm para la síntesis de Vg disminuye, evidenciando el hecho de que la abeja no fabricará  mas Vg, pese a  no haber logrado las reservas necesarias.
De esta forma podemos establecer que la disponibilidad de proteína natural (pan de abeja) o artificial (Apipromotor®) estimulan tempranamente en la vida de la obrera la producción de ARNm de Vg,  y por ende, los títulos de proteínas totales necesarios para el normal desarrollo y longevidad del organismo.

Conclusiones
El consumo del compuesto Apipromotor® genera en la abeja A. mellifera un efecto en los niveles de expresión génica y consecuente síntesis de vitelogenina similar al pan de abejas, por lo que puede ser utilizado en la industria apícola en reemplazo de polen cuando la oferta es escasa o nula.
El consumo del compuesto Apipromotor® genera en la abeja A. mellifera niveles de proteínas similares a los producidos por el consumo del  pan de abejas, asegurando así la normal atención de la cría, la recolección de polen y longevidad de la abeja.
La expresión génica de vitelogenina ha demostrado ser un parámetro cuantificable válido al momento de comparar la eficacia de las dietas proteicas y es de esperar que también lo sea al evaluar  la calidad nutricional de los distintos pólenes que recolecta la abeja.

Sarlo, E.1; Quintana, S.3; Medici, S.1,2,3,; Eguaras, M.1,2 Fey, M.4
1 Laboratorio de Artrópodos, Universidad Nacional de Mar del Plata. 2 CONICET 3 Fares Taie Instituto de Análisis. 4 Apifey SA